Canine Parvovirus Moleküler Tanısında Primer Seçimi ve Önemi
Özet
Canine parvovirus (CPV) köpeklerin kanlı ishali olarak da bilinmektedir ve özellikle aşısız hayvanlarda yüksek mortalite ile seyretmektedir. Hastalığın etkeni tek zincirli DNA genomuna sahip olan Canine Parvovirus-2’dir. En fazla etkilediği grup henüz aşılanmamış veya aşılandıktan sonra yeterince bağışıklık oluşmasını beklemeden diğer hayvanlarla temas ettirilen yavru (1 ay ve altı) köpeklerdir. Her ne kadar spesifik bir tedavisi olmasa da hızlı teşhis konulması, karıştığı diğer hastalıklardan ayrılarak alınacak önlemlere rehberlik etmesi bakımından önemlidir. Teşhis olarak klinik semptomlar yeterli olmadığı için çabuk testler ile desteklenerek tanı konulması en sık kullanılan yaklaşımdır. Bunun harici polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler yöntemler ile kesin teşhis koyulmaktadır. Fakat PCR testlerinde doğru teşhis için en önemli olan parametre çoğaltılması hedeflenen gen bölgesi ve buna yönelik oligonükleotid primerlerin seçimidir. Seçilen gen bölgesi özellikle teşhis için seçiliyorsa genel olarak mutasyona kapalı bölgelerden seçilmelidir. Bu çalışmada CPV şüpheli olan 12 köpeğe ait kan örneği 3 farklı primer kullanarak incelenmiştir. Kan örnekleri lökosit tabakası çıkarmak için 2000 devirde santrifüj edilmiş ve orta tabakada toplanan tabaka pipet yardımı ile 1,5 ml steril polistren tüplere aktarılmıştır. Viral DNA ekstraksiyonu için fenol/kloroform yöntemi kullanılmıştır. Kapsit kodlayan proteine yönelik üç farklı primer çifti HFor/HRev (hedef lokasyon 3556-3575/4185–4166), Pbs/Pbas (hedef lokasyon 4043–4062/4470–4449) ve Pabs/Pabas (hedef lokasyon 3025–3045/ 3706–3685) ile önce optimizasyonlar yapılmış ve sonrasında örnekler her primer çifti için farklı PCR reaksiyonları ile test edilmiştir. Her primer çiftinden PCR reaksiyonu sonucunda sırasıyla 7, 5 ve 12 adet pozitiflik elde edilmiştir. Bu durumun sahada var olan CPV genotip (2a, 2b ve 2c) varyantlarında meydana gelen mutasyonların bir yansıması olarak karşımıza çıkmaktadır. Sonuç olarak bu durum bize sahada yaygın olarak teşhis konulan viral hastalıklarda bile zaman içerisinde meydana gelen mutasyonların tanıda güçlüklere neden olabildiğini göstermektedir. Çalışmamızın sonuçları her zaman birden fazla primer ile çalışmanın önemini vurgulamaktadır.
